Proteinexpression & Aufreinigung von GFP
Lernlabor
Bilder von Kevin Gaa, Biotechnologisches Gymnasium, Marie Baum Schule, Heidelberg

Lyse der Bakterien und Aufreinigung mit der Ni-NTA Säule

1.) Fügen Sie 2 ml Lyse/Waschpuffer zu dem Zellpellet und lösen es mit der Pipette. Fügen Sie 40 µl 10% Triton X-100 zu, mit der Pipette mischen. Fügen Sie 50 µl Lysozym Lösung zu, mit der Pipette mischen. Fügen Sie 50 µl DNase I Lösung hinzu, mit der Pipette mischen.

2.) Stellen Sie den Ansatz für 5 Minuten auf Eis. Stellen Sie sicher, dass keine DNA mehr vorhanden ist!!!

3.) Transferieren Sie jeweils 1ml Ansatz in ein 2ml Reaktionsgefäß, fügen Sie 1 ml Waschpuffer zu und mischen Sie sorgfältig. Zentrifugieren Sie das Lysat für 10 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in der Eppendorf Zentrifuge bei 4°C.

abzentrifugiertes Pellet

4.) Um die Ni-NTA Säule zu pre-equilibrieren laden Sie 0.65 ml Waschpuffer. Zentrifugieren Sie die Säule bei 2000 rpm für 1 Minute bei 4°C.

5.) Laden Sie 0,65 ml Überstand auf die pre-equilibrierte Ni-NTA Säule, bei 2000 rpm zentrifugieren, Durchfluss entfernen. Wiederholen Sie den Ladeschritt weitere 2 Mal.

6.) Waschen der Säule: Laden Sie 0.65 ml Waschpuffer, bei 2000 rpm zentrifugieren und Durchfluss abkippen.

7.) Waschen der Säule: Laden Sie 0.65 ml HochSalz Puffer, bei 2000 rpm zentrifugieren und Durchfluss abkippen.

 8.) Proteinelution: Laden Sie 0.25 ml Elutions Puffer, bei 2000 rpm zentrifugieren. Sammeln Sie das Eluat in einem neuen Reaktionsgefäß

9) Anschließend werden die Proben in der SDS Polyacrylamid Gelelektrophorese analysiert