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Kurs Hämochromatose plus

Experimente: PCR, Restriktionsverdau, Plasmidisolierung, Agarose-Gelelektrophorese
Klassenstufe:
11-13
Dauer: ca. 6 Std.
Materialkosten pro Person: 10 Euro
erforderliche Theoriekenntnisse: Aufbau der DNA, Basenpaarung, Doppelhelix, Anwendung der PCR, Taq Polymerase, Restriktionsenzyme, Plasmide.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (kurz: PCR für engl. Polymerase Chain Reaction) ist eine Methode, um DNA zu vervielfältigen, ohne einen lebenden Organismus wie z.B. E.coli zu benutzen. Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien für eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet, z.B.für das Erstellen genetischer Fingerabdrücke, für Vaterschaftstests, für das Klonieren von Genen und vieles mehr. Eine wichtige Anwendung findet die PCR beim Nachweis von Erbkrankheiten. Im Praktikumsversuch werden von den Teilnehmern DNA-Proben von 3 fiktiven Mitgliedern einer Familie mit einer PCR vervielfältigt. Die entstandenen PCR-Produkte werden dann mit einem spezifischen Restriktionsenzym geschnitten und die entstandenen Fragmente mit der Technik der Agarose-Gelelektrophorese analysiert.

Restriktionsverdau
Restriktionsendonukleasen
sind Enzyme, die DNA-Moleküle aufschneiden, wobei sie die Schnittstelle an einer spezifischen Nukleotidsequenz erkennen. Man nutzt sie in der Gentechnik zur Herstellung definierter DNA-Fragmente bzw. zum "Aufschneiden" eines Plasmids, um dann die Fragmente wieder zu neuen DNA-Molekülen zu rekombinieren. In diesem Experiment wird eine spezifische Restriktionsendonuklease verwendet, um die PCR-Produkte hinsichtlich einer möglichen Mutation zu charakterisieren.

Plasmidisolierung
Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die in Bakterien neben der DNA des "Bakterienchromosoms" vorliegen können. Sie tragen Informationen, die den Bakterien einen Selektionsvorteil gegenüber Plasmid-freien Bakterien bringen. Häufig sind Plasmide Träger von Antibiotika-Resistenzen. In der Gentechnik werden Plasmide als Vektoren verwendet, um Fremd-Gene in Bakterien einzuschleusen. Im Praktikum soll die Isolierung eines Plasmids aus einer Bakterienkultur durchgeführt werden. Der Nachweis der isolierten Plasmid-DNA erfolgt durch die Agarose-Gelelektrophorese.

Agarose-Gelelektrophorese
Die Agarose-Gelelektrophorese ist die übliche Technik, um die Größe der DNA-Moleküle zu bestimmen bzw. verschieden große Moleküle zu unterscheiden. In diesem Kurs werden die durch Restriktionsverdau der PCR-Produkte entstandenen Fragmente gelelektrophoretisch analysiert.